No category

پایان نامه رایگان با موضوع تحلیل آماری، رگرسیون

dder (Vivantis)
7.3- مواد استفاده شده جهت اثر دادن آنزیم محدود کننده
آنزیم محدود کنندهhinf1 و EcoRV(Fermentas) و بافرEcoRV و بافرv3
8.3-استخراج DNA از خون محیطی
استخراج DNA از خون کامل به روش جوشاندن (Boiling) انجام شد که جزئیات روش کار طبق موارد گفته شده در منبع مورد نظر میباشد. (Newton CR et al, 1995)
9.3- استخراج DNA از بافی کت با کیت DNP
1- 5 ماکرولیتر Protease را روی 100 ماکرولیتر از نمونه بافی کت ریخته و آن را به مدت 10 ثانیه ورتکس میکنیم سپس تیوب ها را به مدت 10 دقیقه درون Hot plate 72 درجه سانتیگراد قرار میدهیم.
2- بعد از بیرون آوردن تیوب ها از Hot plate 72 درجه، 400 ماکرو لیتر Lysis Solution ریخته و به مدت 20- 15 ثانیه ورتکس میکنیم تا یک سوسپانسیون کاملا هموژن بدست آید بطوری که هیچ لخته یا ماده حل نشدنی درون تیوبها مشاهده نشود.
3- به محلول فوق 300 ماکرولیتر از Precepitation Solution اضافه کرده و برای 5 ثانیه ورتکس میکنیم، سپس تیوبها درون سانترفیوژ با دور g 12000به مدت 10 دقیقه قرار میدهیم.
4- بعد از بیرون آوردن از سانترفیوژ محلول رویی تیوب ها را خالی کرده و تیوب ها را روی یک دستمال به مدت 3-2 ثانیه قرار میدهیم.
5- تیوب ها را برگردانده و به هر کدام 1 میلی لیتر از Wash Buffer اضافه کرده و به مدت 5-3 ثانیه ورتکس کرده و مجددأ درون سانترفیوژ با دورg 12000 این دفعه به مدت 5 دقیقه قرار میدهیم.
6- بعد از اتمام زمان سانترفیوژ مایع رویی را خالی کرده و رسوب ته تیوب را نگه داشته و برای اینکه -Wash Buffer درون تیوبها کاملا خشک شود آن ها را به مدت 5 دقیقه درون Hot plate 65 درجه قرار میدهیم.
7- بعد از خشک شدن تیوبها آن ها را بیرون آورده و 30 ماکرولیتر از 8ه اضافه کرده تیوبها را به آرامی تکان میدهیم و مجددأ درون Hot plate 65 درجه قرار میدهیم به مدت 5 دقیقه تا رسوب ته تیوب که همان DNA است به خوبی حل شود. DNA بدست آمده را در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری می-کنیم.
10.3-PCR10
از واکنش زنجیرهای پلیمراز جهت تعیین ژنوتیپهای چندشکلی ژنتیکی ژنهایCAT C-262T و NQO1 C609T استفاده کردیم. برای انجام این کار مواد مورد نیازی که در بالا ذکر شد را از فریزر 20- درجه سانتیگراد بیرون میآوریم. لازم به ذکر است که آنزیم Tag پلیمراز را در آخر، هنگام اضافه کردن بیرون میآوریم. بعد از آب شدن مواد در دمای اتاق جهت درست کردن میکس آنزیم آنها را روی یخ قرار می-دهیم. کلیه مواد به جزdNTP قبل از استفاده به مدت 5 ثانیه ورتکس میکنیم. جهت تهیه 20 ماکرولیتر مخلوط واکنش به ازای هرتیوب، مواد مورد نیاز را طبق جدول 2.3 با هم مخلوط میکنیم.
جدول 2.3- مواد مورد نیاز جهت تهیه مخلوط واکنش PCR
اجزای واکنش
حجم مورد نیاز به ازای هر واکنش (μl)
10x PCR buffer
5/2
dNTP (10 mM)
5/0
MgCl2 (50 mM)
75/0
10) پرایمر رفتμM(
1
10)پرایمر برگشتμM(
1
Taq DNA polymerase
3/0
آب استریل
95/13
DNA template
5
پرایمرهای رفت و برگشت مورد استفاده جهت تکثیر قطعه مورد نظر از ژنNQO1:
Forward primer 5’-TCC TCA GAG TGG CAT TCT GC-3’
Reverseprimer 5- TCT CCT CAT CCT GTA CCT CT-3’
(Sameer AS et al, 2010)
پرایمرهای رفت و برگشت مورد استفاده جهت تکثیر قطعه مورد نظر از ژن CAT :
Forward primer 5’-CTGATAACCGGGAGCCCCGCCCTGGGTTCGGATA-3’
Reverse primer 5’-CTAGGCAGGCCAAGATTGGAAGCCCAATGG-3’
(Zarbock R et al. 2007)
بعد از اینکه مخلوط واکنش را آماده کردیم در هر تیوب 20 ماکرولیتر از مخلوط ریخته و به آن 5 ماکرولیتر DNA template اضافه میکنیم. برای انتقال قطرات چسبیده به دیواره به ته تیوب، به مدت چند ثانیه -spin down میکنیم و در دستگاه PCR قرار میدهیم. جهت انجامPCR از مراحل آورده شده در جداول 3.3 و 5.3 استفاده میکنیم.
جدول 3.3- برنامه تنظیم شده برای واکنش PCRجهت تکثیر ژن NQO1
مرحله
دما(°C)
زمان
دناتوراسیون اولیه11
94
7 دقیقه
41سیکل دناتوراسیون12
94
30 ثانیه
اتصال13
58
30 ثانیه
طویل شدن14
72
30 ثانیه
بسط نهایی15
72
5 دقیقه
در ژن NQO1 محصول PCR یک قطعه 230 جفت بازی است. پس از پایان PCR، به 10 ماکرولیتر از محصول PCR، 2 ماکرولیتر از بافرV3و 25/0 ماکرولیتر (معادل 5 واحد) از آنزیم hinfIاضافه کرده و تیوب ها را به مدت 17 ساعت درون Hot plate37 درجه سانتیگراد قرار میدهیم. پس از گذشت مدت زمان لازم، نمونهها را از Hot plate خارج کرده، به منظور جمع آوری قطرات Spin down میکنیم و جهت تفکیک قطعات DNA حاصل از هضم آنزیمی، آن را به دستگاه الکتروفورز منتقل میکنیم.
پس از هضم آنزیمی توسط آنزیم HinfI قطعات bp 200 برای ژنوتیپ CC و قطعات bp151 و bp49 نمایانگر ژنوتیپ TT وقطعات bp200، bp151 و bp 49 نشان دهنده ژنوتیپ CT بدست میآید.
جدول 4.3- قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های چندشکلی ژنتیکی NQO1
ژنوتیپ
قطعات (جفت باز)
CC
200
CT
49، 151، 200
TT
151،49
جدول 5.3- برنامه تنظیم شده برای واکنش PCRجهت تکثیر ژن CAT
مرحله
دما (°C)
زمان(min)
دناتوراسیون اولیه
95
5
35 سیکل دناتوراسیون
94
1
اتصال
68
1
طویل شدن
72
1
بسط نهایی
72
5
در ژن کاتالاز قطعات DNA حاصل از PCR190 جفت بازی میباشند. پس از پایان PCR، به 10 ماکرولیتر از محصول PCR، 2 ماکرولیتر از بافرEcoRVو 25/0 ماکرولیتر (معادل 5 واحد) از آنزیم EcoRV اضافه کرده و تیوبها را به مدت 16 ساعت در Hot plate37 درجه سانتیگراد قرار میدهیم. پس از پایان این مدت زمان، نمونهها راخارج کرده، Spin down
میکنیم و به الکتروفورز منتقل میکنیم. آلل -262T که آلل موتانت این چندشکلی میباشد، جایگاهی برای اتصال و برش توسط آنزیم EcoRV ندارد. بنابراین، باند 190 جفت بازی نشان دهنده آلل موتانت این چند شکلی است. آلل CAT -262C توسط آنزیم EcoRV برش خورده و دو قطعه 157 و 33 جفت بازی بوجود میآید. قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های این چند شکلی در جدول6.3 نشان داده شدهاند.
جدول 6.3- قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های چندشکلی ژنتیکی CAT
ژنوتیپ
قطعات
TT
190
CT
33، 157، 190
CC
157،33
11.3- الکتروفورز
به منظور مشاهده قطعات DNAحاصل ازRFLP16، جهت تعیین چندشکلی ژنتیکی CAT C-262TوNQO1 C609T، آنها را به ژل 5/1 % آگاروز منتقل میکنیم. برای تهیه ژل 5/1 %، 72/1 گرم پودر آگاروز را با 115 سی سی TBE 0.5x مخلوط کرده و با قرار دادن شانه درون ژل چاهک درست میکنیم. پس از سرد شدن ژل و خارج کردن شانه مواد حاصل از هضم آنزیمی را با x Loading 6 مخلوط و به چاهک ها منتقل میکنیم در یکی از چاهکها bp DNA Ladder100 به عنوان نشانگر طول قطعات میریزیم و با برقراری جریان الکتریکی قطعات DNA حاصل براساس اندازه خود در طول ژل از قطب منفی به مثبت دستگاه الکتروفورز حرکت کرده و از هم جدا میشوند.
12.3-رنگ آمیزی ژل
به منظور اینکه قطعات DNA روی ژل آگاروز قابل رؤیت شود، ژل را از دستگاه الکتروفورز بیرون آورده و به مدت 10الی 15 دقیقه درون ظرف حاوی اتیدیوم بروماید (µg/ml1) قرار میدهیم، پس از آن ژل را درون دستگاه Gel documentation قرار داده و با روشن کردن نور UV از آن عکس گرفته و مشاهده میکنیم.
شکل 1.3- نتایج حاصل از PCR -RFLPچند شکلی ژنتیکی CAT C-262T
قابل مشاهده بر روی ژل آگاروز
شکل 2.3- نتایج حاصل از PCR -RFLP چند شکلی ژنتیکی C609TNQO1
قابل مشاهده بر روی ژل آگاروز
13.3- تحلیل آماری
نتایج حاصل از مطالعه که برروی بیماران پیوند کلیه و چندشکلی ژنهای CAT وNQO1 انجام گرفت بانرمافزار SPSS، با به کارگیری روش کای اسکور (x2) و آنالیز آماری رگرسیون لوجستیک و آزمون t-test با در نظر گرفتن سطح معنیداری ٠۵/٠P< مورد تجزیه و تحلیل قرار دادیم.

این مطلب مشابه را هم بخوانید :   پایان نامه با کلید واژگانperceptions

Leave a Reply