سیستم تنظیم نسبت رقیق شدن فاز مایع و فاز جامد،
مخزن خنک کننده‏ی فاز مایع و فاز جامد.
۳-۶-۲ محلول بزاق مصنوعی
ترکیب شیمیایی مورد نیاز جهت تهیه محلول بزاق مصنوعی جهت آزمایش سیستم کشت پیوسته دو جریانه، به شرح زیر است (ولر و پیلگریم، ۱۹۷۴).
۷۶/۱ گرم فسفات هیدروژن دی‏سدیم بدون آب
۵ گرم کربنات هیدروژن سدیم
۶/۰ گرم کلرید پتاسیم
۶/۱ گرم کربنات هیدروژن پتاسیم
۱۲/۰ گرم سولفات منیزیم ۷ آبه
موارد فوق را با یکدیگر مخلوط و بعد با استفاده از آب مقطر حجم آن به یک لیتر رسانیده شد و سپس با همزن کاملاً مخلوط گردید و برای شبیه سازی باز چرخ نیتروژن ۴/۰ گرم اوره به آن اضافه شد.
۳-۶-۳ آزمایش کشت پیوسته دو جریانه
۸ فرمنتر کشت پیوسته دو جریانه با حجم ۱۷۵۰ میلیلیتر در دو دوره متوالی ۹ روزه (۶ روز عادت پذیری و ۳ روز نمونهگیری) مورد استفاده قرار گرفت. فرمنترها با مایع شکمبه به دست آمده از کل محتویات شکمبه ۳ حیوان که با جیره معمولی گاو تغذیه شدند تلقیح گردیدند. دما در ۵/۳۸ درجه سانتیگراد و نرخ رقت فاز مایع (۱۰درصد بر ساعت) و فاز جامد (۵ درصد بر ساعت) ثابت نگه داشته شد. شرایط بیهوازی با تزریق مداوم نیتروژن حفظ شد. بزاق مصنوعی به طور مداوم به فلاسکهای تخمیر تزریق شده و برای شبیهسازی باز چرخ نیتروژن ۴/۰ گرم بر لیتر اوره به آن افزوده شد (ولر و پیلگریم ، ۱۹۷۴). فرمنترها روزانه با ۱۲۰ گرم ماده خشک در سه بخش مساوی در ساعتهای ۸، ۱۶و ۲۴ تغذیه میشدند.
تیمارها با چینش طرح بلوک کامل تصادفی شامل تیمار یک شاهد (بدون کادمیوم)، تیمار دو سولفات کادمیوم (۲۰میلیگرم در کیلوگرم جیره)، تیمار سه سولفات روی و سولفات کادمیوم به ترتیب (۴۵۰ و۲۰ میلیگرم در کیلوگرم جیره) و تیمار چهار بنتونیت و سولفات کادمیوم به ترتیب (۴/۲ درصد ماده خشک جیره بنتونیت و ۲۰ میلیگرم کادمیوم در کیلوگرم جیره) با جیره مشابه آزمون تولید گاز به واحدهای آزمایشی اختصاص یافتند. کنترل pH با تزریق اسیدکلریدریک ۳ مولار یا سود ۵ مولار (هوور، ۱۹۷۶) توسط pH متر صورت گرفت.
۳-۶-۳ نمونهگیری
طی روزهای نمونهگیری (سه روز آخر هر دوره) مخازن جمعآوری خروجیهای فلاسکهای تخمیر (فاز جامد و مایع) با قرار دادن در آب سرد با دمای ۲ درجه سانتیگراد خنک نگه داشته میشدند تا از فعالیت میکروبی جلوگیری به عمل آید. خروجیهای فاز جامد و مایع با یکدیگر مخلوط شده و پس از همزده شدن به مدت یک دقیقه با استفاده از مخلوطکن، نمونهای ۵۰۰ میلیلیتری از کل مخلوط گرفته شد. در انتهای هر دوره نمونههای گرفته شده در طی سه روز گذشته، یکی شد و پس از مخلوط کردن به مدت دو دقیقه، نمونههایی برای اندازهگیری نیتروژن کل و نیتروژن آمونیاکی گرفته شد. مابقی نمونه خشک شده و برای ماده خشک، خاکستر، الیاف نامحلول در شوینده خنثی و الیاف نامحلول در شوینده اسیدی آنالیز شدند.
۳-۶-۴ تعیین نیتروژن کل
برای تعیین نیتروژن کل از روش کجلدال (Foss Tecator مدل ۲۳۰۰، سوئد) استفاده گردید. برای این منظور ۵/۰ گرم از ماده خشک نمونه به داخل فلاسکهای هضم کجلدال ریخته و پس از اضافه نمودن قرص کاتالیزور (حاوی ۵/۱ گرم سولفات پتاسیم K2SO4 و ۱۵/۰ گرم سولفات مس ۵ آبه CuSO4.5H2O) و ۷ میلیلیتر اسید سولفوریک ابتدا هضم و بعد ۷ میلیلیتر آب مقطر و سپس تیتراسیون آن صورت گرفت (AOAC ).
3-6-5 اندازهگیری تغییرات نیتروژن آمونیاکی در فرمنترها
به منظور برآورد الگوی تغییرات نیتروژن آمونیاکی در دوره عادتپذیری کشت پیوسته، ۲ ساعت پس از خوراک دهی صبح و همچنین در روزهای نمونهگیری تا ۸ ساعت پس از خوراکدهی صبح برای هر دوره آزمایش نمونهبرداری از مایع شکمبه درون فلاسکهای تخمیر و جهت اندازهگیری جریان نیتروژن آمونیاکی، از خروجی فازهای مایع و جامد درون مخازن جمعآوری انجام پذیرفت. ۲۰ میلیلیتر از مایع شکمبه پس از صاف کردن با ۲۰ میلیلیتر اسیدکلریدریک ۲/۰ نرمال (۷/۱۶ میلیلیتر اسیدکلریدریک مرک ۳۷ درصد در یک لیتر آب مقطر) مخلوط گردید و بلافاصله در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری شد. در نهایت نیتروژن آمونیاکی مایع شکمبه بر طبق دستورالعمل زیر و با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Biochrom مدل Libra ساخت کشور انگلیس) اندازهگیری شد (برودریک و کانگ ، ۱۹۸۰).
۳-۶-۵-۱ آمادهسازی محلول فنل
ابتدا ۱۵/۰ گرم سدیم نیترو فروسیانید را در ۵/۱ لیتر آب مقطر حل نموده و سپس با ۳۳ میلیلیتر فنل ۹۰ درصد مخلوط و با افزودن آب مقطر حجم آن به ۳ لیتر رسانیده شد. محلول بدست آمده بلافاصله به شیشه تیره رنگ انتقال یافت.
۳-۶-۵-۲ آماده سازی محلول هیپوکلریت
در ابتدا ۱۵ گرم سود سوزآور مرک را در ۲ لیتر آب مقطر حل نموده و سپس ۶/۱۱۳ گرم دیسدیم هیدروژن فسفات ۷ آبه در حرارت ملایم به آن افزوده شد. پس از خنک شدن محلول حاصل، ۱۵۰ میلی لیتر سفید کننده تجاری به آن اضافه و حجم محلول با افزودن آب مقطر به ۳ لیتر رسانیده شد. در ادامه محلول به دست آمده توسط کاغذ واتمن شماره ۱ صاف شده و به بطری پلیاتیلنی انتقال یافت.
۳-۶- ۵-۳ آماده سازی محلول استاندارد