محلول الف (۱/۰ گرم آنزیم پپسین در ۱۰۰۰ میلیلیتر محلول اسید کلریدریک ۱/۰ نرمال)
محلول ب (۱۶/۰ گرم آنزیم پانکراتین در ۳۰۰ میلیلیتر بافر فسفات، ۸ =pH)
3-3-1-21- بررسی تغییرات پلیپپتیدی پودر پروتئین ماهی
جهت بررسی تغییرات پلی پپتیدی از روش لاملی (۱۹۷۰) و نشانگر ۲۰۰-۱۰ کیلو دالتون به عنوان استاندارد مولکولی استفاده شد. برای این منظور پس از فرایند استخراج، غلظت پروتئین با روش بیورت بررسی و غلظت نمونهها یکسان شد. بافر نمونه و عصاره پروتئین به نسبت برابر به یک میکروتیوب اضافه شد و ۱۰ دقیقه در حمام آب جوش قرار گرفت. سپس میکروتیوبها در ۱۰۰۰۰ دور در دقیقه برای ۱۰ دقیقه سانتریفوژ شدند. تانک الکتروفورز حاوی ژل الکتروفورز با بافر تانک پر شد و ۲۰ میکرولیتر از سوپرناتانت حاصله با سرنگ همیلتون به چاهک دستگاه الکتروفورز تزریق شد. نشانگر پروتینی هم به ژل مشابه در همان دستگاه تزریق شد. ولتاژ ۸۰ برای ژل بالا و ۱۵۰ برای ژل پایین بکار گرفته شد. فرایند حدود ۱۲-۹ ساعت به طول انجامید. ژل ۲۴ ساعت در محلول رنگ آمیزی سپس ۴۸ ساعت در محلول رنگبری بود تا باندها به خوبی نمایان شوند. محلول رنگآمیزی در ۶-۵ بار در طول مدت رنگبری تعویض شد. در انتها تصویر ژلها با استفاده از نرم افزار Gel p6 Analyzer بررسی شد و وزن مولکولی باندها تعیین شد.
جدول ۳-۱- محلولهای لازم برای انجام آزمایش الکتروفورز
محلول ترکیبات به میلیلیتر
بافر تانک تریس (۵/۴ گرم)+ SDS (5/1 گرم)+ گلایسین (۶/۲۱ گرم)+ آب مقطر (۱۵۰۰ میلیلیتر) (pH 8/6)
بافر ژل پایین تریس (۲/۱۸ گرم)+ آب مقطر (۱۰۰ میلیلیتر) (pH 8/8)
بافر ژل بالا تریس (۱/۶ گرم)+ آب مقطر (۱۰۰ میلیلیتر) (pH 8/6)
بافر نمونه آب مقطر (۲۵/۲ میلیلیتر)+ SDS %10 (4 میلیلیتر)+ بافر ژل بالا (۲۵/۱ میلیلیتر)+ گلیسرول (۲ میلیلیتر)+ بتامرکاپتواتانول (۵/۰ میلیلیتر)+ برموفنل بلو (نوک سوزن)
محلول رنگ آمیزی متانول (۱۲۵ میلیلیتر)+ اسید استیک (۲۵ میلیلیتر)+ کوماسی برلیانت بلو (۲۵/۰ گرم)+ آب مقطر (۱۰۰ میلیلیتر)
محلول رنگبری متانول (۴۰ میلیلیتر)+ اسید استیک (۳۰ میلیلیتر)+ آب مقطر (۳۳۰ میلیلیتر)
محلول استوک اکریلامید اکریلامید (۳۰ گرم)، دیس اکریلامید (۸/۰ گرم) به حجم ۱۰۰ میلیلیتر رسید و از کاغذ صافی واتمن شماره ۲ گذرانده شد.
جدول ۳-۲- ترکیبات ژل پایین (جدا کننده)
ترکیبات حجم (برای تهیه ۲۷ میلیلیتر) به میلیلیتر
آب مقطر ۶۸۳/۱۰
اکریلآمید ۳۰ درصد ۹
بافر ژل پایین (۸/۸ pH) 795/6
سدیم دودسیل سولفات ۱۰ درصد ۲۷/۰
آمونیوم پر سولفات ۲۷/۰
تمد ۰۲۷/۰
جدول ۳-۳- ترکیبات ژل بالا (متراکم کننده)
ترکیبات حجم (برای تهیه ۲۷ میلیلیتر) به میلیلیتر
آب مقطر ۹۸۱/۴
اکریلآمید ۳۰ درصد ۵۶۱/۱
بافر ژل پایین (۸/۸ pH) 25/2