پدر و مادر عزیزم
سپاسگزاری
سپاس یگانه ای را که زمین بر گرد عرش کبریائی او میگردد و آسمان به رنگ مهربانی اوست
معبودی که دریا در برابر شکوهش پیشانی به سنگ می ساید و کوه در برابر عظمتش بر جای مانده است.
سپاس که با علم و ایمان به حیات دنیا و عقبایم معنا بخشیدی!
در طول مراحل مختلف انجام این پژوهش، از همکاری افراد بزرگواری برخوردار بوده‌ا‌‌م که لازم می‌دانم از یکایک این عزیزان مراتب تقدیر، تشکر و سپاسگزاری را به جای آورم.
از مادر عزیز و مهربان و پدر دلسوزم که همواره با صبر و بردباری و تشویق و دلگرمی هایشان امید به آینده را در من تقویت نمودند، تشکر ویژه کرده و دستانشان را بابت همه چیز
می بوسم.
مراتب سپاس و قدردانی خود را نسبت به زحمات بی دریغ استاد راهنمای ارجمندم جناب آقای دکتر ایرج سعادت، به خاطر تقبل راهنمائی اینجانب، صبر و حوصله فراوان و منابع مفیدی که در اختیار بنده گذاشتند، ابراز می دارم.
راهنمایی‌های ارزشمند، سازنده و زحمات استاد مشاور ارجمندم جناب حمیدرضا کربلایی و دکتر محمد حسین کریمی را در راستای پیشبرد پایان نامه اینجانب ارج می نهم.
چکیده
بررسی ارتباط چند شکلی ژنتیکی ژن هایCAT C-262T وNQO1 C609T
با خطر رد حاد پیوند کلیه
به کوشش
مهسا صحرائیان
پیوند کلیه، درمان انتخابی برای بیماران مبتلا به مرحله نهایی بیماری کلیوی یا End Stage Renal Disease (ESRD) است. در بیماران پیوند کلیه “رد حاد پیوند کلیه” جدیترین عارضه محسوب میشود که در صورت تشخیص سریع، احتمالا برگشتپذیر خواهد بود. شواهد زیادی وجود دارد مبنی بر اینکه آسیب اکسیداتیو به عنوان فاکتور مهم در پیدایش و پیشرفت تعدادی از بیماریها از جمله سرطان، بیماریهای عصبی، دیابت و بیماری مزمن کلیوی نقش دارد. آنزیمهای NQO1 و کاتالاز ( CAT) از جمله آنزیمهای آنتی- اکسیدانت هستند، که از سلولها در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت میکنند. هدف از این مطالعه، بررسی ارتباط چند شکلی ژنتیکی ژنهای CAT C-262TوNQO1 C609T با خطر رد حاد پیوند کلیه میباشد. در این مطالعه مورد-شاهدی ۲۲۴ فرد سالم به عنوان گروه کنترل و ۲۲۲ نفر بیماران پیوند کلیه شرکت داشتند. از روش PCR-RFLP جهت تعیین ژنوتیپ چند شکلیهای ژنتیکی استفاده کردیم. با توجه به نتایج بدست آمده ارتباط معنیداری بین فراوانی ژنوتیپها و آللهای ژن NQO1 در دو جمعیت سالم و بیماران پیوندی مشاهده نشد درنتیجه میتواند حاکی از این باشد که فراوانی ژنوتیپی و آللی ژن NQO1 در بروز بیماریهای کلیوی منجر به پیوند کلیه نقشی ندارد. در مورد ژن CAT از مقایسه ژنوتیپهای ژن کاتالاز در دو جمعیت سالم و بیمار اختلاف معنیدار فقط در ژنوتیپ CT این ژن مشاهده شد که این عامل میتواند در آسیبهای کلیوی که سبب نارسایی شدید کلیه و در نهایت منجر به پیوند میگردد نقش داشته باشد. (۵۱/۱=OR، ۲۵/۲=۹۵%CI، ۰۴۳/۰=P) همچنین مقایسه فراوانی ژنوتیپی و آللی این دو ژن بین دو گروه بیماران با رد حاد و فاقد رد حاد پیوند انجام شد که در ژن CAT هیچ ارتباط معنیداری مشاهده نشد. (۰۵/۰(۶۴/۱ =OR، ۷۳/۲-۹۹/۰ = %۹۵ CI، ۰۵/۰ =P)
کلید واژه: پیوند کلیه، رد حاد پیوند، CAT, NQO1
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه
۱٫۱- پیوند کلیه ۲
۲٫۱- رد پیوند کلیه ۴
۳٫۱- رد حاد پیوند ۴
۴٫۱- DGF ۶
۵٫۱- آنتی بادی های ضد HLA ۶
۶٫۱- آنتی بادی علیه آنتی ژن های گروه خونی ۷
۷٫۱- افزایش سن اهدا کننده و دریافت کننده پیوند ۷
۸٫۱- اهدا کننده بافت ۸
۹٫۱- استرس اکسیداتیو و آنتی اکسیدانتها ۸
۱۰٫۱- کاتالاز ۹
۱۱٫۱- NAD(P)H کوئینون اکسیدوردوکتاز۱ ۱۱
۱۲٫۱- هدف ۱۲
۱۳٫۱- فرضیه ۱۲
عنوان صفحه
فصل دوم: مروری بر تحقیقات پیشین
۱٫۲- مطالعات انجام شده بر روی ژن کاتالاز ۱۴
۲٫۲- مطالعات انجام شده بر روی ژن NQO1 ۱۶
۳٫۲- مطالعات پیشین انجام شده در خصوص پیوند کلیه ۱۸
فصل سوم: مواد و روش ها
۱٫۳- نمونهگیری ۲۰
۲٫۳- وسایل مورد نیاز ۲۱
۳٫۳- محلولهای استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه خون کامل ۲۱
۴٫۳- محلولهای استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه بافیکت ۲۱
۵٫۳- مواد لازم جهت انجام PCR ۲۲
۶٫۳- مواد لازم جهت انجام الکتروفورز ۲۲
۷٫۳- مواد استفاده شده جهت اثر دادن آنزیم محدودکننده ۲۲
۸٫۳- استخراج DNA از خون محیطی ۲۲
۹٫۳- استخراج DNA از بافیکت با کیت DNP ۲۳
۱۰٫۳- PCR ۲۴
۱۱٫۳- الکتروفورز ۲۷
۱۲٫۳- رنگآمیزی ژل ۲۸
۱۳٫۳- تحلیل آماری ۲۹
عنوان صفحه
فصل چهارم: نتایج
۱٫۴- مشخصات افراد شرکت کننده در این مطالعه ۳۱
۲٫۴- نتایج حاصل از بررسی ریسک فاکتورهای دخیل در رد پیوند کلیه
و مشخصات بیماران ۳۱
۳٫۴- نتایج حاصل از بررسی چندشکلی ژن CAT در افراد سالم
و بیماران پیوند کلیه ۳۳
۴٫۴- نتایج حاصل از بررسی چندشکلی ژن NQO1 در افراد سالم
و بیماران پیوند کلیه ۳۴
۵٫۴- مقایسه فراوانی ژنوتیپی و آللی بین دو گروه سالم و بیمار ۳۵
۶٫۴- مقایسه فراوانی ژنوتیپی و آللی بین بیماران با رد حاد پیوند
و بیماران فاقد رد حاد پیوند ۳۶
۷٫۴- بررسی ارتباط ژنوتیپهای ژن CAT و NQO1 با ریسک
فاکتورهای رد حاد پیوند کلیه ۳۸
فصل پنجم: بحث و نتیجهگیری
بحث و نتیجهگیری ۴۰
پیشنهادات ۴۵
فهرست منابع و مأخذ ۴۶
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول ۱٫۳- ۲۰
جدول ۲٫۳- مواد مورد نیاز جهت تهیه مخلوط واکنش PCR ۲۴
جدول ۳٫۳- برنامه تنظیم شده برای واکنش PCR جهت تکثیر ژن NQO1 ۲۵
جدول ۴٫۳- قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپهای
چندشکلی ژنتیکی NQO1 ۲۶
جدول ۵٫۳- برنامه تنظیم شده برای واکنش PCR جهت تکثیر ژن CAT ۲۶
جدول ۶٫۳- قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های
چندشکلی ژنتیکی CAT ۲۷
جدول ۱٫۴- بررسی ریسک فاکتورهای دخیل در رد پیوند کلیه
و مشخصات بیماران ۳۲
جدول ۲٫۴- بررسی ریسک فاکتورهای کمی دخیل در رد پیوند کلیه
و مشخصات بیماران ۳۳
جدول ۳٫۴- مقایسه ژنوتیپ های ژن CAT در گروه سالم و بیمار پیوند کلیه ۳۳
جدول ۴٫۴- مقایسه ژنوتیپ های ژن NQO1 در گروه سالم و بیمار پیوند کلیه ۳۴
جدول ۵٫۴- آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژنCAT در بین گروه سالم
و بیماران پیوند کلیه ۳۵
جدول ۶٫۴- آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژنNQO1 در بین گروه سالم
و بیماران پیوند کلیه ۳۵
عنوان صفحه
جدول ۷٫۴- آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی در ژن CAT
در بین بیماران پیوند کلیه ۳۷
جدول ۸٫۴- آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی در ژن NQO1
در بین بیماران پیوند کلیه ۳۷
جدول ۹٫۴- اثر ریسک فاکتور منبع بافتی باژنوتیپ های ژنCAT ۳۸
جدول ۱۰٫۴- اثر ریسک فاکتور منبع بافتی باژنوتیپ های ژن NQO1 ۳۸
فهرست شکلها
عنوان صفحه
شکل ۱٫۱- ساختار ژن CAT و چندشکلی ژنتیکی CAT C-262T ۱۰
شکل ۲٫۱- ساختار ژن NQO1 و چندشکلی ژنتیکی NQO1 C609T ۱۱
شکل ۱٫۳- نتایج حاصل از PCR-RFLP چندشکلی ژنتیکی CAT C-262T
قابل مشاهده بر روی ژل آگاروز ۲۸
شکل ۲٫۳- نتایج حاصل از PCR-RFLP چندشکلی ژنتیکی NQO1 C609T
قابل مشاهده بر روی ژل آگاروز ۲۹
فصل اول
مقدمه
۱٫۱-پیوند کلیه
پیوند کلیه به عنوان درمان انتخابی برای بیماران با مرحله نهایی بیماری کلیوی۱ (ESRD) که از عوامل مختلف ناشی میشود، تبدیل شده است. ESRD نشانه ای برای پیوند کلیه است که در آن میزان فیلتراسیون گلومرولی کلیه به کمتر از ml/min 15 میرسد. پیامد های پیوند در طول سالهای اخیر به طور قابل توجهی بهبود یافته است. (Sayegh MH et al, 2004, Keith DS et al,2005)
پیوند کلیه یک انسان به انسان دیگر بنام Renal allograft نامیده میشود که دهندهی کلیه، انسان زنده (خویشاوند، غیر خویشاوند) یا جسد (عمومأ دچار مرگ مغزی) میباشد. (Phadke G et al, 2011) تا سال ۱۳۸۹ جمعیت بیماران دچار نارسایی کلیه در ایران ۳۲۰ هزار نفر بوده است که ۴۹% این بیماران از روش درمانی پیوند کلیه، ۴۸% از روش دیالیز خونی و ۳% از روش دیالیز صفاقی استفاده میکردند. (Zwieble William J et al, 2000)
برای پیشگیری و درمان پس زدگی عضو پیوندی از داروهای سرکوب کننده سیستم ایمنی استفاده میشود. این داروها انواع متنوعی دارند که هر کدام با مکانیسم جداگانهای باعث سرکوب سیستم ایمنی میشوند و با توجه به شرایط بیمار معمولا یک ترکیب سه دارویی یا دو دارویی برای بیمار تجویز میشود، معمولترین داروهایی که استفاده میشود شامل: ساندیمون، سل سپت، پردنیزولون و اف کا میباشد. به دلیل استفاده از این داروها گیرندگان پیوند کلیه در معرض ابتلا به عفونت و برخی از بدخیمیها میباشند، علاوه بر موارد ذکر شده ممکن است بافت پیوندی دچار پسزدگی شود برای پیشگیری از عوارض مطرح شده، قبل از پیوند آزمایشات کامل فیزیکی برای تشخیص و درمان مواردی که میتواند پس از عمل پیوند باعث بروز مشکلاتی در بیمار شود، انجام میگیرد. تعیین نوع بافت، گروه خون و آنتی بادی، برای تعیین هماهنگی بین بافت و سلولهای دهنده و گیرنده ضروری است. گیرنده پیوند در زمان پیوند نباید هیچ گونه عفونتی داشته باشد، زیرا پس از عمل به دلیل استفاده از دارو های سرکوب ایمنی در معرض خطر عفونت قرار دارد. (Cornell et al,2008) علم پیوند کلیه در نیم قرن گذشته به طور قابل توجهی پیشرفت کرده است که عمدتأ به دلیل درک بهتر سیستم ایمنی بدن در رد پیوند و مدیریت بهتر سرکوب سیستم ایمنی میباشد.
(Morris PJ, 2004, Sayegh MH et al, 2004)
تهدید ایمنولوژیک پیوند کلیه قبل از پیوند شروع میشود و ناشی از اثرات سیستمیک مرگ مغزی دهنده یا ایسکمی- ریپرفیوژن حین عمل میباشد. ایسکمی به دنبال ریپرفیوژن بیان آنتی ژنهای HLA2 را بالا میبرد و باعث به راه افتادن آبشاری از کموکاینها، سیتوکینهای پیش التهابی و مولکولهای چسبنده در پیوند میشود. این افزایش آنتی ژنهای HLA، پاسخ ایمنی و نفوذ سلولی پیوند را تشدید میکند و هر دو این پاسخها خطر رد پیوند را افزایش
میدهد. (Briscoe DM et al, 1998, Kim IK et al, 2008)
اولین پیوند کلیه در ۱۷ ژوئن سال ۱۹۵۰ در Ruth Tucker، بر روی یک زن ۴۴ ساله مبتلا به بیماری پلی- کیستیک کلیه انجام گرفت. کلیه اهدا شده ۱۰ ماه بعد از پیوند رد شد به دلیل اینکه هیچ داروی سرکوب کننده سیستم ایمنی در آن زمان در دسترس نبود. اولین پیوند موفقیت آمیز کلیه، در سال ۱۹۵۴ در بوستون و پاریس در بیمارستان بریگهام توسط جوزف موری و همکارانش بر روی دو قلو های همسان (رونالد و ریچارد) انجام گرفت. (Petechuk D, 2006) اولین پیوند کلیه در ایران در سال ۱۳۴۶ شمسی در شیراز انجام شد.
( Wishart DS, 2008, Ghods AJ, 2002)
2.1-رد پیوند کلیه
رد پیوند همواره از موانع اصلی در پروسه پیوند بوده است. پیوند بافت یا سلول از یک دهنده که از نظر ژنتیکی با دریافت کننده پیوند متفاوت است باعث به وجود آمدن یک پاسخ ایمنی بر علیه آنتی ژن های فرد دهنده پیوند میشود که اگر کنترل نشود، این پاسخ ایمنی پیوند را از بین میبرد. رد پیوند ناشی از مکانیسمهای مختلف مرتبط با آنتی بادیها، سیستم کمپلمان، سلولهای T ودیگر انواع سلولها میباشد. انواع مختلف سلولها در پیوند به عنوان هدف توسط این واسطهها تحت تأثیر قرار میگیرند به خصوص سلولهای اندوتلیال و سلولهای توبولی. برخی از واسطههای التهابی، به عنوان مثال اینترفرون گاما میتواند حساسیت پیوند به آسیب را تغییر بدهد. رد پیوند را میتوان به وسیلهی تطبیق مولکولی بین دهنده و گیرنده و به وسیلهی استفاده از داروهای سرکوب کننده سیستم ایمنی بعد از پیوند کاهش داد. (Frohn C et al, 2001)رد پیوند یک پاسخ ایمنی تطبیقی است که از طریق ایمنی سلولی (بواسطه سلول های T کشنده و القاء آپوپتوز سلول های هدف) و همچنین ایمنی همورال (بواسطه فعال کردن سلول های B ترشح کننده آنتی بادی) انجام میگیرد که این اقدام توسط اجزای پاسخ ایمنی ذاتی (ماکروفاژ ها و پروتئین های ایمنی محلول) همراهی میشود.
۳٫۱- رد حاد پیوند
رد حاد پیوند یک عارضه جدی و مهم بعد از پیوند است و یک عامل مهم در ایجاد رد مزمن پیوند محسوب می-شود. به نظر میرسد این پدیده دارای یک زمینهی ایمنولوژیک بوده و سیستم ایمنی نقش اساسی دارد. رایج-ترین شکل رد حاد پیوند زمانی آغاز میشود که آنتی ژنهای دهنده پیوند بوسیلهی سلولهای عرضه کننده آنتی ژن (APC)3 به لنفوسیتهای T در گیرنده عرضه شود. (Larsen CP et al, 1990) بیوپسی از کلیه پیوندی روش استاندارد برای تشخیص رد حاد است. رد حاد به طور سنتی بر اساس سرعت و شدت فرآیند rejection به گروههای hyper acute، accelerate acute و acute rejection طبقه بندی میشوند.
تشخیص رد حاد نه تنها متکی بر علائم و نشانههای بالینی در بیمار است، بکله بر اساس
دادههای آزمایشگاهی چون بیوپسی بافت صورت میگیرد. آسیب شناس آزمایشگاه به طور کلی به دنبال سه نشانه اصلی بافت شناسی میگردد: ۱- نفوذ سلول های T، که ممکن است با نفوذ ائوزینوفیلها، سلولهای پلاسما و نوتروفیلها همراه باشد، ۲- سازش ساختار آناتومی بافت و ۳- آسیب رگهای خونی. بیماران مبتلا به رد حاد سلولی، یک افزایش ناگهانی در کراتینین سرم، تجمع مایعات و گاهی اوقات تب و tenderness (حساس شدن به لمس) پیوند را نشان میدهند. با درمان فعلی بروز رد حاد در سال اول پس از پیوند تقریبأ ۱۰-۵ % میباشد. از لحاظ پاتولوژیکی رد حاد با تجمع سلولهای تک هستهای در فضای بین توبولی همراه با التهاب در توبولها و گاهی اوقات در رگهای خونی تجلی مییابد. (Colvin RB et al, 2006) حملات رد حاد پیوند کلیه یک عامل خطر برای بقاء کوتاه مدت و بلند مدت پیوند در نظر گرفته میشود. (Pallardo LM et al, 2004) تعدادی از عوامل که بقاء کوتاه مدت پیوند را تحت تأثیر قرار میدهند عبارتند از: عملکرد تأخیری پیوند (DGF)4 ، آنتی بادی-های ضد HLA، نوع اهدا کننده پیوند، گروه خونی، افزایش سن دهنده و گیرنده پیوند، وزن گیرنده، فشار خون بالا، دیابت و… از عوامل خطر قابل توجه برای از دست دادن پیوند میباشند که برخی از این عوامل را به اختصار توضیح میدهیم.
۴٫۱- DGF
از دست دادن پیوند به علت اختلال در عملکرد مزمن پیوند یک نگرانی عمده در دریافت کنندههای پیوند کلیه میباشد. (Briganti EM et al, 2002, Chapman JR et al,2005) وقوعDGF بیش از ۳-۲ هفته بعد از پیوند طول میکشد. علل اختلال عملکرد کلیه بسته به مدت زمان پس از پیوند، منبع ارگان زنده یا جسد، نوع سرکوب سیستم ایمنی، بیماری های زمینهای و… متفاوت است. تخمین زده شده که در ۵۰-۳۰ % از پیوندها اختلال در عملکرد در طول دوره اولیه پیوند گسترش مییابد. (Giral Class M et al, 1998) DGF را میتوان بسته به زمان پس از پیوند به دو نوع زودرس و تأخیری تقسیم کرد. اختلال عملکرد حاد یا تحت حاد کلیه با افزایش ناگهانی کراتینین سرم آشکار میشود. اختلال عملکرد تأخیری پیوند معمولأ ۶ ماه پس از پیوند بروز میکند که با بالا رفتن به آرامی کراتینین سرم خودش را نشان میدهد. اغلب با پروتئنوری با درجه کم و فشار خون بالا همراه است و به میزان ۴-۲ % در هر سال اتفاق میافتد.
۵٫۱- آنتی بادیهای ضد HLA
پاسخهای خود ایمنی عمدتأ بر علیه مولکول های سطح سلول که تحت عنوان مولکولهای ۵MHC خوانده می-شوند، انجام میگیرد. مولکولهای MHC در انسان آنتیژن لکوسیت انسانی (HLA) نامیده میشوند. این مولکولها مسئول ارائه آنتیژنهای خار ج و داخل سلولی به سلولهای سیستم ایمنی از جمله سلولهای T هستند. سلولهای T قادرند مولکول MHC خارجی سلولهای پیوند (به طور مستقیم) یا بعد از پردازش مجدد در سطح گیرنده سلولهای عرضه کننده آنتیژن (غیر مستقیم) تشخیص بدهد. بدن به طور معمول به مولکول-های MHC که از قبل در بدن وجود داشته پاسخ نمیدهد مگر اینکه از طریق بارداری، انتقال خون یا پیوند در معرض سلولهای خارجی قرار بگیرند. هر چه میزان سازگاری مولکولهای MHC دهنده با گیرنده بیشتر باشد سیستم ایمنی میزبان کمتر تحریک شده و پایداری بافت افزایش مییابد. (Morris PJ et al, 2004) اهمیت آنتیژنهای MHC در انسان بدیهی است به طوری که میزان طول عمر بقای پیوند در پیوندهای خواهر برادری با HLA مشابه به طور قابل توجهی بالاتر از پیوند خواهر برادری با HLA غیرمشابه میباشد. (Nankivell BJ et al, 2010) تقریبأ ۲۵ % از رد حاد به علت آنتیبادی علیه آنتیژنهای HLA دهنده صورت میگیرد. (Colvin RB, 2007)
6.1- آنتی بادی علیه آنتی ژنهای گروه خونی
در پیوند کلیه، گروه خونی دهنده کلیه به طور معمول با گروه خونی گیرنده سازگار است. با این حال، پیوند کلیه در گیرندههایی که با فرد دهنده از نظر گروه خونی ناسازگاراند نیز با موفقیت، با استفاده از یک پروتکل تجربی پلاسمافرز یا immunoadsorption که مستلزم حذف آنتیبادی در گیرنده پیوند بعد از عمل است، صورت میگیرد. پس از حذف، آنتی بادیهای ضد گروه خونی به سطح قبل از پیوند افزایش مییابند. (Lynch RJ et al, 2008)
7.1- افزایش سن اهداکننده و دریافت کننده پیوند
در مطالعهای که در سال ۲۰۱۰ بر روی عوامل خطر مؤثر در از دست رفتن پیوند انجام شد، نتایج نشان داد که سن اهدا کننده یک عامل پیش آگهی و قابل توجه برای از دست رفتن پیوند است، بدین صورت که با افزایش یک سال در سن دهنده، خطر نسبی از دست رفتن پیوند ۰۵/۱ برابر افزایش مییابد. (Khalkhali HR et al, 2010)
8.1- اهدا کننده بافت
اینکه بافت پیوندی از فرد زنده دریافت شده باشد یا از فرد دچار مرگ مغزی، در بقای طولانی مدت پیوند تأثیر-گذار خواهد بود. به طوری که در بیمارانی که از فرد زنده و به خصوص از خویشاوندان درجه اول بافت میگیرند رد پیوند کاهش مییابد. تا سال ۱۳۸۷ در حدود ۹۵-۹۰ % پیوندها از اهدا کنندگان زنده و ۵ تا ۱۰ درصد آن از طریق پیوند از جسد انجام میگرفت، در حال حاضر، ۹۶ درصد پیوندها از جسد و تنها حدود ۴ درصد از پیوندها از اهدا کننده زنده دریافت میشود. همچنین مطالعات انجام شده در این خصوص حاکی از آن است که حدود ۵۰-۲۰ %، وقوع DGF در بیمارانی که از جسد بافت دریافت میکنند افزایش مییابد که ناشی از اثرات سیستمیک مرگ مغزی دهنده یا آسیب اسیکمی- ریپرفیوژن حین عمل میباشد.
(Nankivell BJ et al, 2010, Giral Classe M et al,1998)
9.1- استرس اکسیداتیو و آنتی اکسیدانت ها
استرس اکسیداتیو در نتیجهی افزایش غلظت گونههای فعال اکسیژن (ROS)6 و یا کاهش آنتی اکسیدانتها صورت میگیرد. (Crawford DA et al, 2011) که نشان دهندهی عدم تعادل در میزان تولید رادیکالهای آزاد و توانایی سیستم دفاع آنتی اکسیدانی در رفع واسطههای واکنش (ROS) و یا ترمیم آسیب به وجود آمده می-باشد. اثرات سمی ناشی از استرس اکسیداتیو که از طریق تولید پراکسیدها و رادیکالهای آزاد ایجاد میشود به تمام اجزای سلول از جمله: پروتئینها، لیپیدها و DNA آسیب میرساند. علاوه بر این، گونههای فعال اکسیژن به عنوان یک عامل پیامرسان در سیگنالینگ اکسید و احیاء عمل میکنند، بنابراین استرس اکسیداتیو میتواند باعث اختلال در مکانیسمهای طبیعی سیگنالینگ سلولی شود.
در انسان استرس اکسیداتیو در توسعه سرطان (BarryH , 2007)، بیماری پارکینسون و آلزایمر (Valko M et al, 2007)، آترواسکلروز، نارسایی قلبی (Singh N et al, 1995)، سندرم x شکننده (Diego-Otero Y et al, 2009)، بیماری خونی سلول داسی شکل (Amer J et al, 2006) و چند بیماری دیگر دخیل است. استرس اکسیداتیو شدیدتر میتواند باعث مرگ سلولها شود، استرس اکسیداتیو در حد متوسط میتواند آپوپتوز را آغاز کند، در حالیکه تنشها شدیدتر باشد ممکن است باعث نکروز شدن گردد. (Lennon SV et al, 1991) برای حفظ عملکرد سلولی در برابر ROS، سلولها سیستم دفاعی آنزیمی (به عنوان مثال: سوپر اکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز) و غیر آنزیمی (به عنوان مثال: گلوتاتیون و
ویتامین هایی با نقش آنتی اکسیدان مثل ویتامین C و E) دارند که به وسیله ی آن ROS راسم زدایی میکنند. (Abdollahi M et al, 2004)
10.1- کاتالاز
کاتالاز آنزیم مشترک در تقریبأ تمام موجودات زنده هوازی میباشد که تجزیه پراکسید هیدروژن (H2O2) به آب و اکسیژن را کاتالیز میکند. (Chelikani P et al, 2004) کاتالاز مجموعهای از چهار زیر واحد یکسان (تترامر) است که هر زیر واحد آن دارای وزن مولکولی در حدود ۶۰ کیلو دالتون میباشد و هر زیر واحد دارای یک گروه هِم میباشد.
(Nagem R et al, 1999)
ژن کاتالاز ۳۴ کیلو جفت باز طول دارد و شامل ۱۲ اینترون و ۱۳ اگزون می باشد. بخش پروموتر ژن کاتالاز غنی از GC و فاقد جعبهی TATA میباشد. ژن کاتالاز انسان بر روی بازوی کوتاه کروموزوم شماره ۱۱ در موقعیت ۱۳ این ژن (۱۳P11) قرار گرفته است. (Quan F et al, 1986) تومور ویلمز (Wilm’s Tumor) یک نئوپلاسم رایج دوران کودکی است که با حذف در اطراف باند ۱۳P کروموزوم ۱۱ همراه است. در بعضی از افراد حذف با کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز همراه است. در بافت پستانداران بالاترین سطح آنزیم کاتالاز در کبد، کلیه و گلبول های قرمز و پایین ترین سطح آن در بافت همبند یافت میشود. Shinga و همکارانش گزارش کردند که در سلولهای عضله صاف عروق و سلول های اندوتلیال آنزیم کاتالاز فاقد فعالیت میباشد. در بافت کبد کاتالاز به طور غالب در پراکسیزومها و در اریتروسیتهای بالغ بصورت آزاد در سیتوزول وجود دارد. (Quan F et al, 1986)
تجزیه پراکسید هیدروژن به آب و اکسیژن بوسیله ی آنزیم کاتالاز، یک فرآیند دو مرحلهای است:
۱)H2O2 + Fe(III)-E → H2O + O=Fe(IV)-E
2) H2O2 + O=Fe(IV)-E → H2O + Fe(III)-E + O2
با وارد شدن پراکسید هیدروژن به جایگاه فعال آنزیم کاتالاز، با اسید آمینه های ۱۴۷Asn و ۷۴His برهمکنش میکند و باعث انتقال پروتون (یون هیدروژن) بین اتم های اکسیژن میشود که این انتقال یون هیدروژن به اتم-های اکسیژن آزاد سبب تشکیل یک مولکول آب میشود و Fe3+ به Fe4+ تبدیل میشود. Fe4+ با دومین مولکول هیدروژن پراکسید واکنش داده، آب و اکسیژن تولید میکند و به Fe3+ تبدیل میشود. (Vetrano AM et al, 2005)
تعدادی جهش و چند شکلی در ژن کاتالاز گزارش شده که بیشتر آنها با آکاتالاسمیا۷ که یک صفت آتوزومال غالب بوده و سطح آنزیم کاتالاز گلبولهای قرمز ۲/۰-۴ % بالاتر از حد نرمال است، همراه میباشد. (Ogata M, 1991)
چند شکلی که در این مطالعه مورد بررسی قرار دادیم، جایگزینی باز سیتوزین به تیمین در موقعیت ۲۶۲- پروموتر ژن کاتالاز بود که افراد حامل آلل T (CT, TT) نسبت به افراد هموزیگوت برای آلل C(CC) به طور قابل توجهی سطح کمتری از آنزیم کاتالاز را نشان
میدهند. (Ahn J et al, 2006)
ساختار ژن CAT و جایگاه چند شکلی مورد نظر در شکل زیر آمده است.
شکل ۱٫۱- ساختار ژن CAT و چندشکلی ژنتیکی CATC-262T
11.1-NAD(P)H کوئینون اکسیدوردوکتاز۱ (NQO1)
NQO1 یک آنزیم سیتوزولی است که قبلأ تحت عنوان DT-diaphorase نامیده میشد، از آنزیمهای مهم در متابولیسم زنوبیوتیکها به شمار میآید. این آنزیم احیاء دو اکترونی ترکیبات quinoid به هیدروکوئینون را کاتالیز میکند. از تولید رادیکالهای آزاد و گونه های فعال اکسیژنی جلوگیری میکند، در نتیجه از سلولها در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت میکند. همچنین فعال سازی برخی از مواد زیست محیطی پیش ساز سرطان موجود در دود توتون و تنباکو مانند ترکیبات نیتروآروماتیک و آمین های هتروسیکلیک را کاتالیز میکند.
(Chen H et al, 1999)
ژن این آنزیم بر روی موقعیت ۲۲ بازوی بلند کروموزوم شماره ۶ (۲۲q16) قرار دارد. طول این ژن ۲۰ کیلو جفت باز است که ۵ اینترون و ۶ اگزون را در خود جای داده است.
(Ernster L,1987)
چند شکلی مورد بررسی در این مطالعه مربوط به جایگزینی اسید آمینههای سیتوزین به تیمین در موقعیت ۶۰۹ اگزون شماره ۶ ژن NQO1 میباشد که اسید آمینه پرولین جایگزین سرین میشود. (Wiencke JK et al, 1997) این جهش با کاهش فعالیت آنزیم همراه است و در ۲۵-۱۳ % ازجمعیت سفید پوستان دیده میشود. (Chen H et al, 1999) به طوری که آنزیم NQO1 در افرادی که ژنوتیپ TT دارند، یا فاقد فعالیت است یا فعالیت کمی دارد.(Siegel D et al, 1999) و افرادی که ژنوتیپ هتروزیگوت (CT) دارند تقریبأ نیمی از فعالیت آنزیم را دارند.
در شکل زیر ساختار و جایگاه چند شکلی ژنتیکی ژن NQO1 آمده است:
شکل ۲٫۱- ساختار ژن NQO1 و چند شکلی ژنتیکی NQO1 C609T
12.1- هدف
از آنجا که رد حاد پیوند در حفظ بافت بصورت کوتاه مدت و بلند مدت دارای اهمیت است، مطالعات بسیاری بر روی عوامل ایمنی و غیر ایمنی مؤثر در رد حاد پیوند انجام گرفته است. چند شکلی ژنتیکی تک نوکلئوتیدی (SNP)8 از معمولترین تنوعات ژنتیکی در ژنوم انسان هستند و پتانسیل زیادی برای کاربرد در بررسی رابطه آن با تعدادی از بیماریها دارد. رادیکالهای آزاد اکسیژن به عنوان واسطههای پاتولوژیک در بسیاری از بیماری-ها دخیل هستند. استرس اکسیداتیو با پیشرفت بسیاری از بیماریها از جمله سرطان، بیماریهای عصبی، دیابت و بیماری مزمن کلیوی مرتبط است.یکی از سیستمهای دفاعی علیه آسیبهای ناشی از استرس اکسیداتیو در انسان آنزیم کاتالاز و NQO1 میباشد،از آنجا که استرس اکسیداتیو می تواند در نکروز شدن بافت تأثیر بگذارد، بر آن شدیم تا یک SNP در ژن CAT و یک SNP در اگزون ۶ ژن NQO1 را بررسی کنیم. این مطالعه جهت بررسی ارتباط پلی مورفیسمC-262T ژن کاتالاز وC609T ژن NQO1 با رد حاد پیوند کلیه در بیماران دریافت کنندهی کلیهی پیوندی میباشد.
۱۳٫۱- فرضیه
ژنوتیپTT و CTنسبت به ژنوتیپ CC در چند شکلی ژنتیکی C-262T ژن CAT خطر رد حاد پیوند کلیه را افزایش میدهد.
با افزایش آلل T در ژن CAT، خطر رد حاد پیوند کلیه افزایش مییابد.
ژنوتیپ TT و TC از چند شکلی ژنتیکی C609T ژن NQO1 درمقایسه با ژنوتیپ CC خطر رد حاد پیوند کلیه را افزایش میدهد.
با افزایش آلل T در ژن NQO1، خطر رد حاد پیوند کلیه افزایش مییابد.
فصل دوم
مروری بر تحقیقات پیشین
۱٫۲- مطالعات انجام شده بر روی ژن کاتالاز
مطالعات بسیاری بر روی ژن کاتالاز و رابطه چند شکلیهای ژنتیکی آن با بیماریهای مختلف انجام گرفته است که به شرح زیر میباشد:
مطالعهای در سال ۲۰۰۹ توسط Piort Galecki و همکارانش بر روی ارتباط بین پلی مورفیسم عملکردی ژن CAT(C-262T) و احتمال افسردگی راجعه صورت گرفت که نتایج بدست آمده نشان داد هیچ ارتباط معنی-داری بین پلی مورفیسم ژن کاتالاز و خطر ابتلا به افسردگی وجود ندارد. (Galecki P et al, 2009)
در مطالعه ای که توسط Ozbay و همکارانش در سال ۲۰۱۱ بر روی ارتباط بین سطح آنزیمهای آنتی اکسیدانت خون و زمان حمله میگرن در بیماران مبتلا به میگرن انجام شد، کاهش آماری قابل توجهی در فعالیت GST-PX، CAT، SOD و سطوح GSH در بیماران مبتلا به میگرن در مقایسه با گروه شاهد مشاهده شد.(CAT, GSH P<0> در مطالعهای که توسط Ahn و همکارانش در سال ۲۰۰۵ در خصوص ارتباط خطر سرطان سینه و ژنوتیپ کاتالاز و استفاده از میوه و سبزیجات و مکمل های غذایی در جزیره لانگ انجام شد نشان داد که فعالیت بالای ژنوتیپ CC ژن کاتالاز با کاهش ۱۷ % خطر ابتلا به سرطان سینه در مقایسه با افرادی که حداقل یک آلل T دارند (TT,CT) مشاهده شد.
(AhnJ et al, 2005)
در مطالعه ای که توسط Ji-Yeob Choi و همکاران درسال ۲۰۰۷ در بررسی پلی مورفیسمهای Ala16Val ژن Mn-SOD، C-262T ژن CAT و Pro200Lue ژن GPX1 و خطر ابتلا به سرطان پروستات بر روی مردان با سابقه کشیدن سیگار یا قرار گرفتن در معرض آزبست بودنند انجام شد، هیچ ارتباطی بین ژنوتیپهای Mn-SOD، CAT و GPX1 و خطر ابتلا به سرطان پروستات دیده نشد. (Choi JY et al, 2007)
در مطالعهای که توسط CristianoCapurso و همکارانش در سال ۲۰۰۸ در ارتباط با رابطه چند شکلی C-262T ژن CAT و بیماری آلزایمر انجام شد ، هیچ ارتباطی بین بیماری آلزایمر و این چند شکلی مشاهده نشد. (Capurso C et al, 2008)
در مطالعهای که توسط Zarbock و همکارانش در سال ۲۰۰۷ در ارتباط با خطر بیماری پسودوگزانتوما- الاستیکوم و چند شکلی ژنتیکی C-262T ژن CAT انجام شد، نشان داد که آلل C در این چند شکلی خطر ابتلا به این بیماری را افزایش میدهد.
(Zarbock R et al, 2007)
در مطالعهای که توسط Chistiako و همکارانش در سال ۲۰۰۶ در رابطه با پلی مورفیسم T>C262 پروموتر ژن کاتالاز و ارتباط آن با نوروپاتی دیابتی نوع ۱ در روسیه انجام شد، نتایج نشان داد که آللT 262- در ژن کاتالاز علیه توسعه سریع بیماری نوروپاتی دیابتی نوع۱ نقش حفاظتی دارد. (Chistiako DA et al,2006)
در مطالعهای که توسط Chang Dong و همکارانش در سال ۲۰۱۲ در ارتباط با پلی مورفیسم CAT -21 AT با سرطان کولورکتال انجام شد، تفاوت معنیداری بین ژنوتیپهای ژن CAT و همچنین فعالیت آنزیمی پایین تر در بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. فعالیت کم آنزیم CAT با افزایش ریسک ابتلا به سرطان کولورکتال در ارتباط است، با این حال، هیچ مدرکی در حمایت از ارتباط پلی-مورفیسم CAT -21 AT با خطر ابتلا به سرطان کولورکتال مشاهده نشد. (Chang D et al, 2012)
مطالعهای در سال ۲۰۰۶ توسط Mak و همکارانش در هنگ کنگ چین بر روی بیماران مبتلا به آسم و ارتباط آن با پلی مورفیسم CAT C-262T صورت گرفت که نشان داد، آلل T در جمعیت غیر سیگاری، در برابر بیماری آسم نقش حفاظتی دارد. (Mak et al, 2006)
مطالعهای در سال ۲۰۰۵ توسط Zhou و همکارانش بر روی دو SNP در پروموتر ژن کاتالاز و ارتباط آن با فشار خون بالا در سفیدپوستان و آمریکاییهای آفریقایی تبار انجام شد. اطلاعات بدست آمده نشان داد که تغییرات ژنتیکی در منطقه پروموتر ژن کاتالاز با استعداد ابتلا به فشار خون بالا در ارتباط است. (Zhou XF et al, 2005)
۲٫۲- مطالعات انجام شده بر روی ژن NQO1
مطالعهای درسال ۲۰۰۳ توسط Lin Pو همکارانش در ارتباط با بررسی سه پلی مورفیسم ژنتیکی در ژنهای NQO1، گلوتاتیون S – ترانسفراز و سوپراکسیددیسموتاز با خطر ابتلا به سرطان ریه در تایوان انجام شد، نشان داد که به طور کلی پلی مورفیسم NQO1 و Mn-SOD با خطر ابتلا به سرطان ریه در ارتباط نیست. افراد حامل آلل نوع GSTP1 در معرض خطر بالای سرطان سلولهای سنگفرشی ریه هستند. با در نظر گرفتن عوامل خطری چون وضعیت سیگار کشیدن، جنسیت و نوع بافت بر روی این پلی مورفیسمها دیدند که نوع وحشی ژن NQO1 با سرطان ریه در افراد سیگاری همراه است. (Lin P er at,2003)
متا آنالیزی در سال ۲۰۱۳ توسط Zhu CL و همکارانش در رابطه با پلی مورفیسم C609T ژن NQO1 با سرطان دستگاه گوارش ۹(DTC) انجام شد که به طور کلی از لحاظ آماری ارتباط معنی داری بین پلی مورفیسم این ژن وخطر DTC وجود دارد. (Zhu CL et al, 2013)
در سال ۲۰۱۳ توسط Hu Yanlig و همکارانش متا آنالیزی در ارتباط با بررسی پلی مورفیسم C609T ژن NQO1 و خطر ابتلا به سرطان مری انجام شد که نتایج بدست آمده نشان داد که ارتباط معنیداری بین ژنوتیپ مغلوب (TT) C609T، NQO1 و سرطان مری وجود دارد. (Yanlig H et al, 2013)
در مطالعهای که توسط Pandith A و همکارانش در سال ۲۰۱۱ در جمعیت کشمیری بر روی ارتباط بین چند شکلی ژنتیکی C609T ژن NQO1 و سرطان مثانه انجام شد، نشان داد که آلل T خطر ابتلا به سرطان مثانه را افزایش میدهد. (Pandith A et al, 2011)
مطالعهای دیگر در سال ۲۰۱۱ توسط Stavropoulou C و همکارانش در ارتباط با چند شکلی C609T ژن NQO1 و خطر ابتلا به بیماری های آلزایمر و پارکینسون انجام گرفت که در آن آلل T خطر ابتلا به این بیماری ها را افزایش میداد. (Stavropoulou C et al, 2011)
مطالعهای در سال ۲۰۱۳ توسط Liu و همکارانش در بررسی ارتباط پلی مورفیسم عملکردی NQO1 C609T و خطر ابتلا به سرطان سلولهای کبدی در جمعیت چین انجام شد. نتایج نشان داد در افرادی که ژنوتیپ TT دارند در مقایسه با افراد دارای ژنوتیپ CC به طور قابل توجهی خطر ابتلا به سرطان سلولهای کبدی افزایش مییابد. (Liu F et al, 2013)
متا آنالیزی در سال ۲۰۱۲ توسط Zhang و همکارانش در رابطه با پلی مورفیسم NQO1 C609T و خطر ابتلا به سرطان معده در آسیاییها انجام شد. نتایج حاصل از مقایسه آلل T و آلل C این ژن نشان داد که در افراد دارای آلل T نسبت به افراد دارای آلل C، به طور قابل توجهی شانس ابتلا به سرطان معده افزایش مییابد. (Zhang Y et al, 2012)
۳٫۲- مطالعات پیشین انجام شده در خصوص پیوند کلیه
مطالعهای در سال ۲۰۱۱ توسط Amanda Crawford و همکارانش بر روی فعالیت آنزیمهای گلوتاتیون پراکسیداز، سوپراکسیددیسموتاز و کاتالاز و پیشرفت بیماری مزمن کلیوی CKD)) انجام شد. SNPهای مورد بررسی شامل: تبدیل اسید آمینه لوسین به پرولین(CT) در موقعیت ۱۹۷ ژن GPX1، تغییر اسید آمینه آلانین به والین (CT) در موقعیت ۱۶ ژن SOD و C-262T در ژن کاتالاز بود.بررسیهای انجام شده نشان داد که SNPهای مورد مطالعه در ژن GPX1 و ژن کاتالاز با پیشرفت بیماری مزمن کلیوی ارتباطی ندارد اما در بیماران CKD که در ژن SOD دارای ژنوتیپهای Ala/Val و Val/Valهستند نسبت به افرادی که دارای ژنوتیپ Ala/Ala هستندکاهش بیشتری در عملکرد کلیه شان نشان میدهند.
(Crawford A et al, 2011)
مطالعهای توسط Singh و همکارانش در سال ۲۰۰۹ در شما هندوستان بر روی ارتباط بین دو ژن GSTM1 و GSTP1 و رد حاد پیوند کلیه انجام گرفت که نشان داد چند شکلیهای این دو ژن رابطه شدیدی با DGF و رد حاد پیوند دارد. (Singh R et al, 2009)
مطالعهای در سال ۲۰۱۳ توسط Guo Y و همکارانش بر روی پلی مورفیسم ژن CTLA4 و بروز عفونت پس از پیوند کلیه در دریافت کنندههای چینی انجام شد که در آن هیچ ارتباطی بین SNP های ژن CTLA
(- ۱۷۷۲ TC, +49 AG,+6230 GA) و عفونتهای باکتریایی پس از پیوند یافت نشد.
(Guo Y et al, 2013)
مطالعهای در سال ۲۰۰۸ توسط Pagliuso و همکارانش بر روی چند شکلیهای ژنهای GSTM1 و GSTT1 با پیشرفت بیماریهای مزمن کلیوی در برزیل انجام شد که نشان داد ژنوتیپهای null این دو ژن هیچ گونه ارتباطی با پیشرفت این بیماری ندارد. (Pagliuso RG et al, 2008)
فصل سوم
مواد و روش ها
۱٫۳- نمونه گیری
در این طرح، مطالعه بر روی ۲۲۲ نفر از بیماران پیوند کلیه در مرکز پیوند بیمارستان نمازی شیراز طی سالهای ۹۱_۱۳۹۰ انجام شد که از این تعداد ۱۴۴ نمونه خون کامل و ۷۸ نمونه بافیکت بود. DNA را از نمونههای خون به روش جوشاندن و از نمونههای بافیکت با استفاده از کیت DNP متعلق به شرکت سیناژن استخراج کردیم. نمونههای کنترل نیز به تعداد ۲۲۴ نمونه در این مطالعه وارد گردید. در نهایت یک مطالعه مورد-شاهدی بین افراد سالم و بیماران پیوند کلیه و یک مطالعه کوهورت بین بیماران پیوند دارای رد حاد و فاقد رد حاد انجام شد. جدول ۱٫۳ مشخصات این بیماران را نشان میدهد. در این مطالعه رد حاد پیوند به افرادی اطلاق میگردد که در طول ۶ ماه اول پیوند با بیوپسی (نمونه برداری از بافت) رد حاد آن ها تایید شدهاست.
جدول ۱٫۳:
مشخصات
سالم
بیماران پیوند کلیه
تعداد کل
میانگین سن
۲۲۴
۱۴/۱۵±۴۹/۴۰
۲۲۲
۵۴/۱۴±۶۸/۴۱
۲٫۳- وسایل مورد نیاز
وسایل استفاده شده در این پروژه شامل:
سمپلر(Brand, Socorex)، ترازو، میکرو سانتریفیوژ (Hettich)، ورتکس (Scientific industries INC)، اتوکلاو (ریحان طب)، مایکروفر (بوتان)، دستگاه ترموسایکلر (Techne)، Hot plate(Techne)،Rotator (پدیده نوژن پارس)، PH-meter(Metrohm)، Electrophoresis(تانک الکتروفورز و منبع تغذیه جریان الکتریکی پایاپژوهش)، دستگاه Gel documentation(UvitecCambridge).
۳٫۳- محلولهای استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه خون کامل
محلولهای استفاده شده شامل:
NaOH (50 میلی مولار)، TrisHCl (1 مولار)، محلول NH4Cl (170 میلی مولار)، محلول NaCl-EDTA (10 میلی مولار) می باشد که از طریق روش گفته شده در کتاب Molecular Cloning: A Laboratory Manual تهیه شدند. (Green MR et al, 2012)
۴٫۳- محلولهای استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه بافی کت
پروتئاز mg/ml 20 (proteinase K)، Lysis Solution، Wash Buffer (Ethanol Base)
Precipitation Solution(Isoprppanole Base)،Solvent Buffer
۵٫۳- مواد لازم جهت انجام PCR
Taq DNA Polymerase (سیناژن)، dNTPs (سیناژن)، MgCl2 (سیناژن)، بافر ۱۰x(10x buffer) مخصوص PCR(سیناژن) و پرایمر های رفت و برگشت ژن CAT و NQO1 (سیناژن)
۶٫۳- مواد لازم جهت انجام الکتروفورز
بافرTBE، محلول اتیدیوم بروماید (x1000)، Tris Base (سیناژن)، Boric acid (Merck)، EDTA (Merck) 6xloading buffer (سیناژن)، Agarose(Invitrogen)، ۱۰۰bp DNA ladder